محیط های کشت

 

امروزه با محیط های کشت استاندارد و شرایط انکوباسیون پیشرفته، کشت سلول های حیوانی بسیار دقیق تر و آسانتر از آنچه سابق بود انجام می پذیرد. از دهه 1950 ، محیط کشت بافت توسعه یافته و شرایط با دقت زیادی در invivo شبیه سازی شدند. خصوصاً، شرایط محیطی با توجه به درجه حرارت، فشار اسمزی، PH، متابولیت های ضروری ( مانند کربوهیدرات ها، آمینو اسید ها، پروتئین ها و لیپید ها)، یون های معدنی، هورمون ها و ماتریکس خارج سلولی تنظیم می شود. در میان مایعات بیولوژیکی که به طور موفقیت آمیزی برای کشت سلول آزمایش شده اند، سرم شاخص ترین مورد است. برای رشد بهینه سلول ها معمولا 5 الی 20 درصد سرم به محیط کشت اضافه می گردد. سرم یک آمیزه بسیار پیچیده از موادی است که شامل ترکیبات تعریف نشده نیز می باشد، بنابراین در حال حاضر پژوهش ها به سمت تولید یک ترکیب شیمیایی شناخته شده جهت جایگزینی سرم پیش می رود.

امروزه تنوع بسیار وسیعی از محیط های کشت در دسترس قرار دارد که انتخاب محیط کشت به احتیاجات سلول ها وابسته است. محتوای یک محیط کشت مناسب شامل:

ü        محیط پایه

اساسی ترین محیط های کشت پایه محلول های متوازن نمکی ( BSS ) هستند. برای مثال Phosphate buffered saline یا PBS که می تواند هم جهت شستشوی سلول ها و هم برای انکوباسیون کوتاه مدت در سسوسپانسیون مورد استفاده قرار گیرد. بیشتر محیط های ترکیبی تعریف شده برای رشد و نگهداری طولانی مدت سلول ها استفاده می شوند. محیط های کشت شناخته شده با اضافه نمودن تعدادی از عناصر سازنده می توانند در بیچیدگی نیز متنوع باشند. برای مثال Eagle’s minimum essential medium یا MEM که حاوی آمینو اسید های ضروری، ویتامین ها و نمک ها است نسبت به محیط McCoy’s که حاوی تعداد بیشتری آمینو اسید های مختلف، ویتامین ها، مواد معدنی و دیگر متابولیت های اضافی ( مثل نوکلئوزید ها ) است.

 

ü        ظرفیت بافری

جهت انجام کشت سلولی لازم است تا تعدادی از مواد مغذی به محیط کشت پایه اضافه گردد. کشت های سلولی یک PH بهینه برای رشد دارند که معمولاً بین 4/7 تا 7/7 است. توع سیستم بافری مورد استفاده به شرایط محیط کشت بستگی دارد. وقتی سلول ها در یک اتمسفر حاوی CO2 انکوباسیون می شوند، یک موازنه ای باید بین محیط کشت و فاز گازی حفظ شود. سیستم بافری بیکربنات- CO2 به دلیل داشتن کمترین میزان سمیت برای سلول ها بیشتر از سایرین مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین بافر دیگری که ممکن است مورد استفاده قرار گیرد HEPES با خاصیت بافری بسیار قوی تر است.

هر نوع محیط به غلظت مشخصی ار بیکربنات و CO2 برای رسیدن به PH و اسمولالیته صحیح نیازمند است. بافر HEPES به طور نرمال باید در پیوند با بی کربنات مورد استفاده قرار گیرد، چراکه ارتباط موجود بین HEPES و بی کربنات سطوح مختلف CO2 مورد نیاز را تعین می کند. اگرچه HEPES به تنهایی می تواند PH را در غیاب CO2 خارجی حفظ نماید. اضافه نمودن 1 الی 5 میلی مول پیرووات به محیط نیز، تولیدات داخل سلولی حاصل از CO2 را افزایش داده و نیاز به CO2 اتمسفری را محدود می نماید. برخی محیط های شناخته شده به همین منظور ساخته شده اند، برای مثال محیط کشت Leibovitz L15 . همچنین سلول هایی که مقادیر بالایی از CO2 را تحت شرایط خاص انکوباسیون تولید می کنند ممکن است به HEPES جهت بافرینگ CO2 تولید شده نیاز داشته باشند.

غلظت کشت می تواند نیاز CO2 را تحت تأثیر قرار دهد. به هر حال، عموماً فنل رد در محیط شرایط PH را در هر زمانی مشخص خواهد نمود.

 

ü        گلوتامین و آمینو اسید ها

علاوه بر سیستم بافری برای محیط کشت، ملزومات دیگری مانند آمینواسید ها برای رشد وجود دارند که با توجه به نوع سلول می تواند بسیار متنوع باشند. معمولاً آمینواسید های ضروری شامل سیستئین و تایروزین می شوند اما ممکن است برخی آمینواسید های غیر ضروری هم مورد نیاز باشند. گلوتامین هم برای بیشتر لاین های سلولی مورد نیاز است و پیشنهاد شده است که سلول های کشت شده گلوتامین را به عنوان یک منبع انرژی و منبع کربن به گلوکوز ترجیح دهند، هر چند گلوکوز در بیشتر محیط های تعریف شده وجود دارد. گلوتامین معمولاً در غلظت نهایی 2 میلی مولار اضافه می شود. اگر چه یکبار اضافه کردن گلوتامین به محیط تنها به مدت 3 هفته در 4 درجه سانتی گراد پایداری دارد.

 

ü        سرم

اگرچه تحقیقات زیادی با هدف کاهش نیازمندی سلول ها به سرم به وسیله جیگزینی آن با مواد مغذی دیگر در محیط صورت گرفته است اما به نظر می رسد که لاین های سلولی همچنان برای رشد مناسب خود به سرم نیازمند باشند. منابع متنوعی برای تهیه سرم وجود دارند مانند گوساله، جنین گوساله و اسب. اغلب سرم جنین گوساله بهترین شرایط رشدی را در محیط کشت سلول فراهم می کند. سطح مورد استفاده سرم اختصاصاً به نوع لاین سلولی بستگی دارد و باید به صورت تجربی مشخص گردد. بچ های سرمی ممکن است به طور قابل ملاحظه ای در توانایی شان جهت حمایت رشد سلولی متنوع باشند. بنابراین نست کردن بچ های سرمی از این لحاظ اهمیت دارد. برای چک کردن مشخصات و ویژگی های بچ های سرمی، میزان کونینگ و مختصات رشدی ( مورفولوژی، الگوی رشد) باید در غلظتی از سرم بین 2 تا 20 درصد انجام شود. این محدوده غلظت در صورتی که تغییراتی در غلظت سرم به منظور بهینه کردن ویژگی های رشدی برای یک لاین سلولی خاص صورت گیرد، بیشتر خواهد شد.

 

 

ü        آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها

در صورت مناسب نبودن شرایط استریلیتی ( برای مثال: نبودن هود های لامینار ) استفاده از آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها در محیط کشت ضروری به نظر می رسد. طیف وسیعی از آنتی بیوتیک های نسبتاً خاص وجود دارد از جمله محلول های پنی سیلین و استروپتومایسین، که به منظور عریض تر نمودن طیف، از مواد آنتی باکتریال و آنتی مایکوتیکال دیگر مثل کانامایسین یا آمفوترین B استفاده می شوند. آنتی بیوتیک انتخابی باید مشخصاً فاقد اثرات سمی برای سلول کشت شده باشد و بسته به نوع آلودگی انتخاب می شود.

 

 

    
    

               Propaganda With BIG Group  |   Copyright 2010 - 2011 by inoclon  |  Design by WebCade